實時熒光定量PCR技術(shù)（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

相對定量應(yīng)用（Relative Quantification，RQ）    

 特異性熒光標(biāo)記：

 TaqMan法

 TaqMan探針的特性：

（1）5′端標(biāo)記有報告基團（Reporter, R），如FAM、VIC等

（2）3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團 （Quencher, Q）

（3）探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光

（4）Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量：
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小，內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量。

相對定量分析方法  ：

 2-ΔΔCt
前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計算表達水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達量的比值

服務(wù)流程：

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同，選擇從步驟1或2啟動項目。